关注｜志贺菌：隐藏在食物中的“杀手”

志贺菌是最常见的食源性致病菌之一，全球每年志贺菌中毒事件居细菌性中毒事件首位。

志贺菌病是由志贺菌引发的一种急性肠胃疾病，临床特征包括发烧、腹部疼痛、中度到重度水样腹泻。一旦治疗不及时，可能会导致肠道炎、脱水甚至死亡，严重危害身体健康，特别是儿童和免疫缺陷人群。志贺氏菌主要存在于手工加工的蔬菜沙拉、鲜奶制品或煮熟后的肉制食品中，常引起食物中毒。

全球 64% 的细菌性腹泻疾病是由该细菌感染所致，每年约有 1.6 亿人感染志贺氏菌，死亡人数高达110万，其中大部分为五岁以下儿童及免疫缺陷人群。在发展中国家由福氏志贺氏菌引起的腹泻疾病位居前列。在我国，每年由志贺氏菌引起的疾病占食源细菌性疾病总数的8.5%，其死亡病例占食源性疾病死亡病例的5.9%。

志贺菌属的细菌，通称痢疾杆菌，是人类细菌性痢疾的病原菌，以病人和带菌者为传染源，灵长类动物（primate）也是其天然宿主。

革兰染色阴性，杆菌， 无鞭毛,有菌毛.在肠道鉴别培养基上形成无色,半透明的菌落.均能分解葡萄糖只产酸不产气,除宋内志贺菌迟缓发酵乳糖外,均不分解乳糖.营养要求不高，在普通琼脂平板上经24h生长，形成直径达2mm大小、半透明的光滑性菌落；志贺菌属中的宋内菌常出现扁平的粗糙型菌落。

A群：即痢疾志贺菌。有10个血清型，其中8个型尚可分为3个亚型，是唯一不能发酵甘露醇的志贺菌。

B群：即福氏志贺菌。有13个血清型（包括变形和亚型）各型间有交叉反应。

C群：即鲍氏志贺菌。有18个血清型。

D群：即宋内志贺菌。抗原单一，只有一个血清型。是唯一具有鸟氨酸脱羧酶的志贺菌。

1.致病物质主要是侵袭力和内毒素,有的菌株尚产生外毒素.

(1)侵袭力 借菌毛粘附,穿入回肠末端和结肠黏膜上皮细胞,在上皮细胞内繁殖,形成感染灶,引起炎症反应.细菌一般不进入血流.志贺菌穿透上皮细胞的能力,由基因所控制.志贺菌只有侵入肠黏膜后才能致病.

(2)内毒素

(a)作用于肠黏膜,使通透性增高,促进对内毒素的吸收,引起发热,神志障碍等.

(b)破坏肠黏膜,形成炎症,溃疡,呈现典型的脓血粘液便.内毒素还能作用于肠壁植物神经系统,使肠功能发生紊乱,肠蠕动失调和痉挛.尤其是直肠括约肌痉挛最明显,因而出现腹痛,里急后重等症状.

(3)外毒素 A群志贺菌I型和II型还能产生外毒素,称志贺毒素.使蛋白质合成中断(上皮细胞损伤).

2.所致疾病

传染源是病人和带菌者.

传播途径主要为粪一口.人类对志贺氏菌较易感.

痢疾志贺菌引起病情较重;宋内志贺菌多引起轻型感染;福氏志贺菌感染易转变为慢性,病程迁延;福氏和宋内志贺菌是我国常见的流行型别.

临床感染类型

(1)急性菌痢 局部症状有脓血便,腹痛,里急后重.

急性中毒性菌痢,以小儿多见,无明显的消化道症状,主要表现全身严重的中毒症状.各型志贺菌都有可能引起.临床主要有高热,神志障碍,休克,病死率较高.

(2)慢性菌痢 病程＞2月,迁延不愈,局部症状为主.

3.病后建立的型特异免疫(SIgA)短暂,不持久,无交叉.

随着检测技术的发展，志贺氏菌的检测方法可分为：传统培养方法、免疫学方法、分子生物学方法。

传统检测方法

食源性致病菌的传统检测技术在现行的食品安全国家标准里均有规范。作为食品微生物检测的“金标准”，《GB 4789.5-2012 食品安全国家标准·食品微生物学检验·志贺氏菌检验》在志贺菌检测中具有举足轻重的地位。国标检测方法包括前增菌、选择性分离、生化鉴定和血清学鉴定，整个过程需要 4~5 d，检测限为 1×104 CFU/mL。国标方法的准确性高且稳定，但操作繁杂，灵敏度较低。Jung等针对目标菌株选择性问题采用噬菌体扩增测定法在多种混合细菌中成功地检出鲍氏志贺氏菌。志贺氏菌的检出率与增菌液和显色培养基的选择以及培养基灭菌的方式有密切关系。在普通培养基上培养痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌，有杂菌时无法生长，容易产生假阴性结果。李志明等在增菌培养基中加入新生霉素、胰胨葡萄糖肉汤及含表面活性剂吐温，可以形成很好的厌氧环境培养志贺氏菌；在显色培养基中加入抗生素，抑制了杂菌生长，保证了培养的准确性。针对灵敏度低的问题，Tang等将qPCR 与传统培养方法结合检测沙门氏菌和志贺氏菌，使传统培养方法的灵敏度提高了 100 倍。传统培养方法作为其他检测方法的基础，将逐渐满足实际检测的需要。

免疫学检测方法

免疫学方法的基本原理：抗原与抗体特异性结合，其在食源性致病菌检测应用中最大的优点在于检测目标的多样性，不仅可以检测样品中痕量致病菌，还能检测细菌毒素。目前应用最广泛的免疫学快速检测技术包括酶联免疫吸附（Enzyme-linkedimmunosorbent assays，ELISA）技术、免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMB）技术和免疫层析（Immunochromatography assay，ICA）技术，近年来免疫学方法不断发展，实现了志贺氏菌的高通量、快速灵敏检测，大大提高了检测效率。免疫学方法操作简便，可在 15 min 内，实现致病菌多重检测，如表 1 所示。Gupta开发并标准化了检测志贺毒素（STxB）的 Dot-ELISA 和夹心 ELISA方法，其检测限分别为 9.75、9.7 ng/mL，该检测方法特异性高，经济高效且可现场检测。胶体金免疫色谱带（ICS）大多采用胶体金作为比色检测的报告剂，不需要特殊的仪器和试剂，使 ICS 的结果可视化。Song等使用一步侧流 ICS 方法对鲍氏志贺氏菌和大肠O157:H7 进行多重分析，与ELISA 结果一致。Yahaya等对侧流免疫分析法（LFIAs）进行研究，确定使用 NC-HF135 硝酸纤维素膜可提高 LFIAs 灵敏度。

分子生物学检测方法

随着微生物学和分子生物学的迅速发展，根据形态结构和生理特性对病原微生物进行鉴定已不能满足实际检测的需要，从分子水平上对生物大分子进行分析逐渐成为研究热点之一，特别是核酸结构及其组成部分。近几年，分子生物学方法包括变温扩增技术和等温扩增技术，已被广泛的应用于食源性病原菌的快速检测。

自 1897 年发现志贺菌以来，其分离培养与常规鉴定技术已经相当成熟。根据国家标准 GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》，检测志贺菌需要增菌和选择性培养后， 再用生化和血清学方法进行鉴定和分型，往往需要数天时间，繁琐费时且检出率低，不能满足现场快速检测的需要。免疫学方法能够实现快速检测，缩短了检测时间，但该方法的灵敏度较低。分子生物学方法可分为变温扩增技术如聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）及其衍生技术和等温扩增技术。分子生物学方法利用聚合酶反应，具有高灵敏、高特异、简便快速的特点，被广泛应用于食源性病原菌的检测。

侵袭性质粒抗原 H （invasion plasmid antigen H，ipa H）基因是存在于志贺菌染色体和侵袭性大质粒上的侵袭基因，高度保守，不随传代而丢失，因此被选作志贺菌的检测靶基因。 但无论是 PCR 还是荧光 PCR 法均需要专用仪器，而恒温扩增技术降低了对复杂仪器的依赖，解决了PCR 的局限性，为资源匮乏地区及现场检测提供了新的技术手段。

重组酶聚合酶扩增是近年来发展迅速的新型核酸等温扩增技术，原理是重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA 复合物能在双链 DNA 中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并启动 DNA 合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。重组酶聚合酶扩增可以在 37～42℃稳定扩增，并且扩增速度快，只需5～20 min 即可完成目标扩增，特别适用于现场检测。

重组酶聚合酶扩增方法特异性强、灵敏度更高，且重组酶聚合酶扩增在等温条件下进行，不仅检测程序简单，检测效率高、耗时更短。其次，重组酶聚合酶扩增技术对设备的要求低，不受场地限制，只需要维持一定温度的恒温设备即可，在缺少设备时甚至可以利用人体腋窝保温进行检测，适用于现场快速检测。同时重组酶聚合酶扩增试剂以冻干粉的形式保存，增加了稳定性，更利于试剂运输和保存，值得口岸应用和推广。