警惕｜不容忽视的百日咳鲍特菌

冬季是呼吸道传染病高发季节，各大医院儿科门诊人满为患，“咳咳咳”声此起彼伏。除了最近高发的肺炎支原体、衣原体感染，还需警惕容易被忽视的“百日咳”。

百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病，主要感染儿童。自从将疫苗接种纳入婴儿常规免疫计划以来，百日咳在全球范围内得到了有效控制。但近年来，在疫苗接种率很高的许多发达国家，如英国、美国、荷兰、澳大利亚等相继报道百日咳的发病率和病死率在保持多年低水平之后再次上升，即所谓的“百日咳再现”。

百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis, BP）为革兰阴性小球杆菌或短细棒杆菌，大小为(0.2～0.5)μm×(0.5～2.0)μm，无芽孢，无鞭毛，为严格需氧菌，营养要求高。百日咳鲍特菌对一般理化因素的抵抗力较弱，56 ℃ 30min、日光照射 1h 即可杀灭，一般消毒剂、紫外线照射也均可将其杀灭。在干燥尘埃中可存活 3d。对大环内酯类药物敏感。多种毒力因子协同作用诱发疾病，包括百日咳毒素(PT)、腺苷酸环化酶毒素(AC)、皮肤坏死毒素(DNT)和气管细胞毒素(TCT)等。百日咳杆菌的表面结构也能影响其毒力，包括丝状血凝素(FHA)、菌毛(FIM)、百日咳杆菌黏附素(PRN)、III 型分泌系统、脂多糖(LPS)和代谢蛋白(如 BrkA、BapC 和 BatB)。在百日咳杆菌中，bvgAS 基因正调控多种毒力因子的表达，包括 PT、AC、DNT、FHA、TcfA、PRN、FIM、BrkA、BipA、BcfA和 Vag8。

研究表明，百日咳鲍特菌发病机制是由细菌首先通过 FHA 和菌毛粘附到气管上皮和肺部。一旦发生粘附，百日咳杆菌会在局部繁殖，抵抗宿主防御机制(如粘液纤毛清除、抗菌肽和炎症细胞)，对上呼吸道和下呼吸道造成局部损害并伴有全身症状。症状的严重程度取决于以下几个因素，包括患者的年龄、免疫反应的强度和细菌在全身传播的程度。在重症的患儿中，细菌从上呼吸道到下呼吸道，通过不清楚的机制造成坏死性支气管炎、弥漫性肺泡损伤、肺泡内出血、纤维蛋白水肿、富含巨噬细胞的肺泡浸润、淋巴管扩张、中性粒细胞支气管肺炎和纤维蛋白血栓。更严重，这些病理损伤可能导致肺动脉高压、呼吸衰竭，甚至死亡。PT诱导白细胞增多(以淋巴细胞为主)，白细胞总数可超过 20×109/μL。增多的白细胞在肺血管中造成淋巴细胞聚集，导致肺血管阻力增加,从而导致肺动脉高压，影响淋巴系统。尸检显示胸腺皮质萎缩，淋巴结淋巴枯竭，脾脏白髓枯竭。但是，关于百日咳的发病机制仍有许多未知之处。如，与吸气相关的“鸡鸣”样回声确切机制尚未明确，一些研究人员认为TCT 可能是主要原因。

百日咳具有很高的传染性。

（1）传染源：人类是百日咳的唯一感染宿主。百日咳患者、隐性感染者和带菌者都是传染源，青少年和成人患者是婴幼儿感染的重要传染源；

（2）传播途径：细菌可以通过接触空气中的飞沫在人与人之间迅速传播；

（3）易感人群：人群普遍易感，主要发生在 5岁以下儿童。由于青少年和成人百日咳临床症状多不典型，不符合世界卫生组织（WHO）确定的百日咳诊断标准，易被漏诊。R0 被定义为在完全易感人群中，一个确诊的初级病例能传播的预期继发病例数。Kretzschmar 等研究发现，20 世纪 90 年代欧洲五个国家(芬兰、德国、意大利、荷兰和英国)百日咳的 R0 约为 5.5；

（4）流行特征：百日咳遍布世界各地，较多发在夏季，春季次之。据世界卫生组织估计，2014 年全球<5 岁儿童百日咳报告病例约 2400 万例，死亡病例约 160700 例。我国自 1978 年实施计划免疫后，DTP 疫苗的接种有效地降低了百日咳的发病率和死亡率。我国国家卫生健康委员会疾病预防控制局 2006 年至 2013年期间，年报病例数 3000 以下，但 2014-2016 年病例数分别达到 3365、6658 和 5584 例，到 2017 年全国共报告百日咳 10390 例,百日咳发病已呈现明显增多趋势。研究表明，百日咳再现可能与以下因素相关：实验室诊断方法的完善提高了对百日咳的认识和监测水平；适龄儿童基础免疫3剂含全细胞百日咳的疫苗后，预防百日咳的免疫保护维持约 4-12 年，疫苗免疫保护逐渐减弱的青年人和成人成为患病的主要人群；百日咳鲍特菌对疫苗免疫和抗生素出现选择性压力的适应性变化。

典型百日咳的潜伏期 2d~21d，一般为 7d~10d。百日咳分 3 个临床阶段：卡他期、痉咳期和恢复期。

（1）卡他期：持续 1~2 周，为上呼吸道感染征象，表现为流涕、低热、流泪、结膜充血及轻微咳嗽，上述症状减轻但是咳嗽日渐加重，进入痉咳期；

（2）痉咳期：持续 2~6 周甚至更长，咳嗽为主要表现，为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽时伴颜面发绀、呼吸发憋，咳剧时面红耳赤，咳毕有鸡鸣样回声，昼轻夜重，血常规白细胞升高，淋巴为主；

（3）恢复期：持续 2~3 周，痉咳发作次数减少，病情减轻，最终消失。

目前用于诊断百日咳感染的实验室检测方法主要包括传统的细菌培养法检测、血清学检测和分子生物学的检测方法。

细菌培养法

培养法特异度非常高，被认为是百日咳诊断的“金标准”，但培养大约需要7~10天，灵敏度较低，总体灵敏度为50%。

血清学检测

血清学检测方法克服了细菌学检测的不足方面，具有较高的灵敏度，但会受到百日咳病程和疫苗接种的影响。

分子生物学检测

分子生物学方法，包括实时 PCR，巢式 PCR，多重PCR和环介导等温扩增技术（LAMP）等技术已被广泛用于百日咳的实验室诊断。

PCR 被认为是分子诊断领域的金标准，与细胞培养、血清学诊断相比，具有灵敏度高、特异性强、周转时间快等优点。

实时 PCR 能在封闭系统内实时观察结果，已经逐渐取代了传统 PCR。多重PCR针对百日咳鲍特菌的多个位点，特异性好，但是多个位点同时检测可能降低方法的灵敏度。

传统的两步巢式PCR 方法灵敏度高，但在第一轮PCR后，需开盖转移扩增产物到第二步PCR 体系中，开盖过程容易造成实验室的交叉污染。

PCR技术需要昂贵的设备和专业的操作，这在很大程度上限制了其在传统实验室和低资源地区的推广及应用。

LAMP 操作简单，不需要热循环系统，但设计 4~6条不同的引物比较繁琐。

重组酶聚合酶扩增检测

重组酶聚合酶扩增检测技术是一种新型核酸恒温扩增检测技术。该技术可以在37~42℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测。

重组酶聚合酶扩增反应主要包含5个阶段：

（1）在三磷酸腺苷供能的条件下，重组酶辅因子（Uvs Y）协助Uvs X与反应体系中的引物结合，形成酶-引物复合体，该复合体在反应体系中寻找双链DNA同源序列；

（2）在同源序列处发生链交换反应形成D环结构，同时Gp32与被置换的DNA单链结合进一步稳定D环结构；

（3）Uvs X从酶-引物复合体中解离，DNA聚合酶识别引物游离的3′-OH端，添加dNTPs启动扩增反应；

（4）模板母链分离，DNA子链合成；

（5）两DNA子链合成完毕。该过程不断循环实现检测靶标的指数扩增直到反应体系中能量消耗殆尽。

重组酶聚合酶扩增检测技术操作简单，具有广阔的应用前景目前，该技术已广泛用于病原微生物检测。